為了生物及醫(yī)藥方面研究的需要,研究者常需制備脂蛋白純品,采用的方法有超速離心法、化學(xué)沉淀法(如硫酸右旋糖苷沉淀法)、凝膠過濾和高壓液相層析法等。迄今為止,采用密度梯度超速離心分離純化各種脂蛋白仍是純度較高、簡便實用的好方法。
超速離心法可分為制備型和分析型兩種,制備型密度梯度離心法可以分為等密度離心法和速率一區(qū)帶密度梯度離心法,可以選用的轉(zhuǎn)頭有角頭、甩平頭、垂直頭和區(qū)帶頭。我們介紹的方法利用不同容量的角式轉(zhuǎn)頭及簡單配制的梯度液,在各種型號的超速離心機上快速分離血清脂蛋白,可以得到滿意的分離效果。
一材料和儀器
1梯度液
A液:11.40gNaC1,0.1gEDTA—Na2,置于1000rnl量筒中,加入500ml重蒸水及1ml1NNaOH,混勻至全部溶解。加重蒸水至1000ml最后再加3rI1l重蒸水(NaCI:0.195mo1)。終密度1.O06g/cm~,pH10.37。
B液:力Ⅱ24.98gNaBr至U100mlA液中(NaC1:0.195mol,NaBr:2.44mo1)。終密度1.182g/cm3,pH9.72。
C液:加78.32gNaBr到100mlA液中(NaC1:0.195mol,NaBr:7.65mo1)。終密度1.478g/cm3,pH8.86。
2離心機、轉(zhuǎn)頭、離心管
(1)離心機:HitachiCP—MX系列超速離心機或其他類似機組。
HitachiCS一150GXL微量超速離心機(2)轉(zhuǎn)頭和離心管:S140AT:140,000rpm,l,050,000×g,10×2ml,K=5,1PC厚壁管。S80AT3:80,000rpm,415,000×g,8×8ml,K=23,6PC厚壁管。S70AT:70,000rpm,505,000×g,8×40ml,K=44,40PA管。
二,離心操作
1血漿一血球分離
全血,角轉(zhuǎn)頭或甩平轉(zhuǎn)頭3000rpm×20min,沉淀為血細(xì)胞,上清血漿待用。
2乳糜微粒分離
離心參數(shù):各種轉(zhuǎn)頭均可用,4×106(g×min),10℃。
梯度液:離心管下部3/4容積為血漿,上部1/4容積為0.15MNaCl+0.3MEDTA,pH7.4。離心結(jié)果:乳糜微粒上浮,離心管傾斜,吸管貼管壁慢吸出(約占血漿容積的2%一6%)。
注意:禁食12h以上供血者血漿中乳糜微粒含量很低,餐后供血者含量較高。
以往文獻(xiàn)報道的密度梯度離心法常常指定離心機和轉(zhuǎn)頭,提供的方法不能推廣,且需要進(jìn)行精確到小數(shù)點后4位的密度標(biāo)定,過程繁瑣。我們采用等密度梯度分離,梯度液的配置簡便可行,不需要做密度測定或光折射率的換算。幾乎所有的超速離心機用戶都有角式轉(zhuǎn)頭,不論機型,均可參照本法用于離心分離脂蛋白,用戶只需根據(jù)所需容量靈活調(diào)整梯度液和樣品的量,并計算出離心時間即可。對大量樣品還可用同樣方法、同樣梯度液進(jìn)行區(qū)帶分離。本法分離出的VLDL、LDL、HDL還可以進(jìn)一步用長離心管縮小不連續(xù)梯度密度差,分離出其亞組分。需要注意配置梯度液時室溫應(yīng)接近離心溫度,所用試劑最好達(dá)到分析純級。
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